小红教你如何分离酵母ヽ(･∀･)ﾉ

富迪 发表于 2014-6-16 19:22
好象很复杂。

原理很简单，细节繁琐了点

啊啊今天忘了实验记录真是太懈怠了_(:з」∠)_……







早上一去肯定先是观察上周五涂的板子长成什么样了。







以上是中蜂蜜第一批转接之后的培养液和板子，几乎就是延续了原来的性状，有菌丝这一条就很糟糕，绝不是酵母菌的菌落状态，当时看到这个结果就很沮丧。于是随后就从原始中锋蜜样品里重新取样重做，结果如下






板子上长出密密麻麻细小的湿润单菌落，培养液浑浊，起码这像是酵母的样子。这两块板子就等它们继续长，再长大一点挑单菌落。


【中1】【中2】的培养液和板子今天已经洗掉了，没有观察价值。
实际上如果是操作不规范导致的错误，全部错在同一个样品的两个平行上，也是挺巧的……不过现在也没有别的可能性，还是应该反省自己。












下面的意蜂蜜的板子和培养液



哎呀……抱头……果然又长成一团了……看来60h还是太久了……


只能重涂了，注意稀释。


虽然我又不准备写论文所以做梯度没什么必要，但是谁知道这么密的板子需要稀释多少倍……所以还是做10倍 100倍 1000倍三个梯度好了…………






我一直在犹豫意蜂蜜也要不要重新取样，因为在不到30℃的情况下，24h都不要竟然就能从一个个单菌落长成菌群，这实在是太快了，快的不像是真菌……倒想是细菌……
但是浓度的问题也有很大干扰就是了……
反正意蜂蜜的板子重新涂，这次做个梯度，慢慢观察，希望时间正常。

今天就是做一个梯度，意蜂蜜的两个培养液，分别作10倍和100倍的稀释，然后涂平板，每个浓度再做两个平行。

本来是准备再做一个1000倍的，但是平板不够，估计1000倍也看不到什么，就算了。



关于做梯度我可能昨天讲的不够清楚——


对于一个平板涂的好不好，我用两幅图说明：


像这样，斑斑点点的，一个个的单菌落分的很清晰，就是好的。


像这样整个都长成了一团，全部连起来了，就几乎是作废了。


具体原因就要扯到涂平板的意义——分离。
上面那张一粒一粒的，就是在涂的时候，那个地方只有一个菌，在室温下，经过48h的生长，这一个菌不断的分裂，就成了一个菌落，这种由一个菌变成的菌落叫【单菌落】。单菌落的好处是，这个小点里的所有菌都是一模一样的，没有跟任何别的菌混起来，把它单独挑出来，这就分离了啊。
下面那张长成一团的……还分离个屁啊……完全就长成饼了啊……


不过长成饼还是有救，就要做梯度。
具体就是无菌操作中，取1ml原液，加入含9ml无菌水的试管中，混匀，这就是稀释10倍的菌液。再取1ml加到9ml无菌水的试管中，混匀，这就是稀释100倍……
然后再取稀释菌液涂平板，以求长成斑斑点点那样。




这是实验前准备的东西……


【我记得我大二刚做实验的时候，这种实验准备每次都不能一次性备齐，不是记号笔没带就是打火机没带，拿了打火机之后，重新消毒再等20min，做到一半发现镊子又没带……往往很简单的实验我当时都要做一个下午…………说真的，这种事情真是太磨练人了……1个月之后我实验前准备就很少做错了，完全是当时给磨的……




这是10倍和100倍的平板涂完之后的样子………上面的标记按要求应该尽量简洁，日期菌种编号和一些关键信息都要有，看的时候比较方便，不过这种事也完全是随个人，我一个大学同学就有强迫症，板子上只能标1 2 3 4 5，然后在记录本上把序号和具体信息对起来，她的板子只有她自己看的懂。










今天刚好有空就随手做了个镜检。
这是400倍的。没染色。就是用手机对着目镜拍的……效果还可以好像……

今天我真是太兴奋了。

前天中蜂蜜的板子已经准备好了，也联系了生物科技公司，但是遇到了一个问题，就是需要起码分辨这个样品究竟是真菌还是细菌，因为真菌细菌的测序方式不一样。

今天昨天两天我一直在找资料找人问真菌和细菌的区别。

细菌直径一般是0.5微米到1微米，真菌的大小相差很大，酵母直径是1微米~5微米或是5微米~20微米——这个在显微镜下根本看不出来啊！目镜里谁能分清楚那放大了1000倍之后的究竟是1毫米还是2毫米啊！
菌落结构酵母跟细菌也是很像，都是湿润凸起的。
虽说我用的是真菌培养基，但是有的细菌也是能在PDA上长的啊……

其实最准确的办法是做染色，比如格兰仕染色，但是我们又没有染液。
如果我是个经验丰富的人，那即使不染色，我镜检一下也能知道，但是我不是。
去找化验室的张师傅，但是因为用的培养基不一样，她也不敢断言。

简直焦躁，特别焦躁。


然后今天下午再次做了个镜检，本来都不抱什么希望…………没想到！！让我看到了黑色的细胞核！！


【啊这个照片不太清晰大家凑合看……
黑色的！细胞核！有没有！
嘤嘤嘤终于确定是真菌了……喜极而泣……




接下来划个斜面，等它长出来之后寄给生物公司就好了。


今天划了斜面，等长出来再给大家看图，现在什么都看不到。


16号做的梯度，100倍和10倍的都长了，但是都是密密麻麻的很小的菌落，图上不怎么看的出来，也是等等再放图好了。

这是17号涂的板子，今天20号，这几天气温平均在20~25℃，真菌类长的比较慢。
上面4个是意蜂蜜第二个样品的，下面4个是第一样品的。左边4个是稀释100倍，右边4个是稀释10倍。然后分别做了两个平行。

就看这个图，显然只有左下的两个板子看的过去，但是也还是有些密。
10倍的显然不行。

下周再涂1000倍的好了……还以为不需要1000倍这么夸张……没想到这瓶长的这么好……



今天还把2瓶中蜂蜜的培养液和2瓶意蜂蜜的培养液，取5ml转入新的培养液，因为旧的估计营养用完了，再不转怕菌会衰退。

又做了11个斜面，以前的竟然碎了，估计是琼脂不够，这次从2%变成3%。

可以尝试着做

青青小草 发表于 2014-6-20 11:52
可以尝试着做

可以的

本来没什么感觉，把你的帖子细细读下来，感觉还蛮有意思的。

王舒嬿 发表于 2014-6-20 13:25
本来没什么感觉，把你的帖子细细读下来，感觉还蛮有意思的。

那最好了

小红就是牛