小红教你如何分离酵母ヽ(･∀･)ﾉ

最近我刚好要做酵母的分离实验，想着放到论坛上来，因为这个毕竟生活中并不常见，也许有人感兴趣呢，可以一起学习。

虽然我知道面对一群不会的人说“嘛，这个很简单啊ヽ(･∀･)ﾉ”显得有点欠揍，但是这件事确实不难，起码原理很简单，具体步骤做起来有点繁琐，而已。











OK下面我们进入正题。













【原理】


嘛~这根本就不是一个严谨学术论文，所以这个原理也并不是严格意义上的原理，就是简单的讲一下要怎么做。


首先，我们要明白我们的最终目标——鉴定中蜂蜜中的酵母，和意蜂蜜中的酵母，是不是同一种酵母<<<<就是【实验目的】


要鉴定两种菌的话，首先要先取得这两种菌……从蜂蜜中取得酵母，就叫【菌种分离】。


其实不管从蜂蜜中分类酵母，还是从海水中分离放线菌，还是从粪便中分离大肠杆菌，原理都是一样一样的。




       首先，我们既然要从样品中分离菌种，那首先要取得一些样品（就是蜂蜜、海水、粪便之类的）<<<<<<这步叫【取样】
       自然样品中的成分很复杂，而且样品中的目的菌种（就是酵母、放线菌、大肠杆菌之类的）含量并不多，所以就需要滤去杂质，然后放入富集培养基中，使目的菌种指数倍增长<<<<<<这步叫【富集】
       上一步的过滤是粗滤，就比如是海水中滤去沙子这种很粗犷的，那海水中除了我们需要的放线菌，还有很多种别的菌，弧菌啊球菌啊杆菌啊，上面那步是过不掉的，需要涂平板然后取单菌落（啊这个我后面详说）<<<<<<这步叫【分离】
       这时我们有了目标菌的单一菌种，我们将含有菌的液体培养基做离心，就是一个机器转转转，液体会有分层，转好几次，有的时候去上清有的时候去沉淀>>>>>因为一个菌里面也有很多东西啊，细胞器啊细胞壁啊细胞膜啊，我们只要DNA别的都要过滤掉，根据转速的不同，DNA会在不同的层里面<<<<<<这步叫【离心】
       这时我们得到了目的菌种的DNA。一步步下来，这里的DNA已经很少了，这么少根本不能测序，就像前面的菌种富集一样，DNA也能富集，叫PCR。PCR有专门的PCR仪。PCR仪的原理也很简单，就是不停的复制DNA，一条变两条 两条变四条 四条变八条<<<<<<<这步叫【PCR】
       这时我们得到了目的菌种的大量DNA，然后就去测序，测序都是专门的生物科技公司做，因为仪器很贵，买不起。大家都知道DNA是遗传密码，密码也有基本单位，DNA的基本单位就4个，用字母表示分别是A T C G，它们的排列顺序决定了一切，这些以兆为单位的遗传信息，决定了物种和物种的区别，个体和个体的区别<<<<<<<一条DNA链，测出其中ATCG的排列顺序，这就是【测序】
       这时我们知道了目标菌种的DNA序列。如果需要做不同菌种的对比，就比比看序列一不一样。如果需要做菌种鉴定，就去BLAST网站上查找序列。大家直接百度【BLAST】，第一个就是的。全世界已知物种的DNA序列都在里面。如果找到了，那就知道了目标菌的具体分类，如果没找到，那恭喜你发现了新物种，可以开始考虑要给这个小可爱取啥名。






做实验呢，根据实验对象的不同，可以分为【做植物】【做动物】【做微生物】【做分子】……（啊其实这是我自己分的……反正差不多这个意思）
前面的步骤中，前三步【取样】【富集】【分离】是属于【微生物】，后面的【离心】【PCR】【测序】【BLAST】都是【分子】，这两者的区别是——分子比较贵，而且毒性大。


就本实验而言，我只能做到【微生物】……实际上，就算只做微生物，实验条件都略艰苦，分子就根本别提了，最基础的PCR仪都没有。所以，分子的部分只能全部找生物公司做。







↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑ 以上，就是本实验的简要概述 ↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑






以后每天做的步骤我会分步贴上来，有兴趣的朋友可以看看

这个实验的前期准备比较久，因为很多基本的玻璃仪器都没有，各种准备，买仪器药品、写实验方案、联系生物公司，前前后后大概用了一个多星期。

今天才开始正式做。



【配培养基】

不同的微生物需要不同的培养基，就像不同的动物食物谱也不一样。

可以培养酵母菌的培养基有几个，我选了一个我们最有条件做的，别的多多少少还要买新药品——PDA培养基。

P D A分别是Potato Dextrose Agar，马铃薯 葡萄糖 琼脂，所以PDA培养基的全称就是马铃薯葡萄糖琼脂培养基<<<<<<啧啧啧，这群搞研究的取名字就是这么简单粗暴……

【配方】 马铃薯 200g     葡萄糖 20g     琼脂 20g     水 1000ml     自然PH

【制作方法】很简单，土豆切丁，放锅里煮，沸腾15min，然后倒出，用纱布滤掉土豆，向土豆液里加葡萄糖（和琼脂），然后放进锥形瓶里灭菌就行了。
（加不加琼脂看你做的是液体培养基还是固体培养基，液体的就不用加）





因为我配的是2000ml培养基，就称了400g土豆。
刀功比较渣……大家凑合看…………



切好之后放锅里煮，加水2L
在沸腾的过程中肯定会有水分蒸发掉，这无所谓，全部加完之后再加水补齐2L就行了。



一个锥形瓶里放1L的PDA培养基。
锥形瓶中的液体高度不能超过整个瓶子的1/3，不然在灭菌的时候很容易涨出来沾到棉塞上，就会染菌。
之所以用棉塞，因为棉塞透气，用橡皮塞的话，高温灭菌的时候塞子就喷出来飞了……然后用报纸包一下，棉线扎紧。



虽说这种培养基和玻璃仪器的灭菌，一个小时不到就能灭一次，但是做的时候还是尽量一步到位，不要临到做实验了发现还有什么没灭，那就比较浪费时间。
这是250ml的空锥形瓶，培养基灭好了之后分装到这个小瓶子里面。
另外还有一些实验中需要的器材我就不一一列举了。


一次实验，做之前都应该写一个实验方案。因为实验中很多细节都很繁琐，哪些步骤可以一起做，哪些步骤可以同时做，事先计划好了做的时候才快，且不易出错。

专业、严谨、人才

今天我做的就是分装和加样。



早上，先去实验室，把昨天灭好的2000mlPDA、12个空250ml锥形瓶、100ml无菌水、1个10ml量筒、1个注射器、一个试管（带橡皮塞），拿出来，准备打火机、75%酒精、酒精灯等工具，一起放入超净台灭菌，然后操作室臭氧灭菌。
实际上条件允许的话，应该先把这些从灭菌锅里拿出来的东西放到烘干箱里烘干，报纸湿的话很容易撕烂，再包裹的时候就没有隔离效果了。不过我们没有烘干箱，就算了。


再讲实验过程之前我先介绍一下【氨苄青霉素】。
又叫【氨苄西林】，英文名Ampicilin，是一种抗生素。
把抗生素加培养基里，其中的目的大家猜都猜的到——抑制一部分杂菌的生长啊。
氨苄西林跟青霉素的抑菌谱差不多，略窄，主要抑制革兰氏阳性菌（就是一种分类方法，经过革兰氏染色之后呈蓝紫色的就是阳性菌，红色的就是阴性菌，造成这个区别的主要原因是细菌的细胞壁厚薄不同……解释起来有点烦，也不太重要，反正就知道这是一种分类方法就行了）。
假设我的实验过程中染菌了，染的又很不巧是革兰氏阳性菌，就只见氨苄西林拿出了大规模杀伤性武器，突突突突，所到之处尸横遍野寸草不生。看那一家子，细菌爸爸撒手菌寰，细胞壁破裂，细胞器随着细胞液流到了体外，细菌妈妈受的刺激太大已经进入休眠期了，细菌儿子嗷嗷待哺，但是这个动荡的年代已经没有葡萄糖分子给它吃了……这种分分钟上亿条生命的感觉真是……对他们来说我就是上帝。
氨苄西林还有一点需要注意的就是，不能高温。所以并不能把它加入培养基然后一起灭菌。
其实了解它的作用原理就很好理解。它的作用方式肯定跟三维结构有关，因为高温会不可逆的破坏分子三维结构。实际上也确实是。氨苄西林分子的三维结构跟构成细菌细胞壁的某一个分子的三维结构很像，所以在细菌形成细胞壁时，氨苄西林就会跟那种分子有竞争关系，等于氨苄西林卡着位，又起不到作用，这样就导致细菌细胞壁不能正常合成，细菌就等于在外面裸奔，连皮都没有，特别脆弱，分分钟就死了。


下图就是氨苄西林
5g，49块，很便宜。


氨苄西林不能承受高温，所以只能培养基灭好了之后再加，这时候就需要【无菌针头式过滤器】，就是下图。
这个是滤孔直径只有0.2um的，进口的，一次性的，6块钱一个。国产的比较便宜，滤孔大一点的也便宜一些。
这个就……看名字就知道用途了，就是装在注射器前面，不管注射器里有什么通天的细菌，打出来的都是无菌，因为滤孔太小细菌过不去。




最终的操作台就是这个样子…………玻璃裂是酒精灯烧的




分装就实在没什么好说的。注意规范操作，不要染菌就行了。
一共分了12个小瓶子，是准备三次富集用的。

下午主要是准备明天是实验和加样。


定明天的实验步骤和材料。
比如洗平板。明天要倒平板。
哎我一边洗着平板就一边想到大二的时候刚进实验室。跟着学长做实验，老师手底下十几个学生根本不管我们，完全是学长教的，这种洗平板的事情全都是我们做，跟着学长做完了整个毕业实验。大三终于能磕磕碰碰的自己做一些实验，用的都是师兄师姐们用剩下的实验材料，PCR我做了一个学期什么结果都没有，跑电泳跑出的胶一片晶莹剔透，跟我一起做的同学都放弃了，我找了很久的书本都不知道为什么，问凶巴巴的师兄也没有结果，最后知道是PCR的引物放的太久自溶了，当时真是特别悲愤，感觉自己的劳动特别不值钱。大四在实验楼里才真的熬出头，跟老师撒娇卖萌借仪器，讨好师兄给他当摄影模特，最后做毕业论文的时候，隔壁养殖班的一个男的临时抱佛脚，毕业还有不到2个月的时候才进实验室，什么都不懂，把我正在灭菌的操作台里的东西都拿出来放到一边自己做，我说他他还特别理直气壮，气的好几个人都说他“太没规矩了”，就是那一刻我发现自己已经不是那个“不懂规矩”的人，而是可以说别人“没规矩”的人，no pains,no gains.





每瓶培养液加5小勺蜂蜜，扎好8层纱布之后做标记。

这里把报纸拿掉了，因为发酵需要氧气，所以不需要棉塞和报纸。

其实这些应该放在摇床里培养，30℃，180r/min，3天。
但是我们没有摇床。
摇床的目的一是恒温，二是保证氧含量。恒温这个好说，空调也可以，氧含量这个，我想用磁力搅拌器代替，不过磁力搅拌器只有两个……所以……就用两个吧……_(:з」∠)_

因为酵母已经进入培养阶段所以今天往后的两天都没什么事。

今天来先是把4瓶培养液放到温暖一些的房间，事先用酒精擦拭台面。

然后就灭了30个平板，做了600ml固体PDA，倒平板，就没了。

学习了

香云 发表于 2014-6-5 20:20
上学时做过PDA，貌似现在都改用现成的

没有吧。。。我在学校也是自己配啊

今天就是去观察了一下液体培养基，平底出现少许絮状沉淀，说明菌群已经开始长了。



补一下昨天的图，忘记放了。


这是用报纸包好的平板，准备灭菌



这是倒好固体培养基之后的平板，等周一，培养液里的菌长的再多一点，就可以取一些涂平板观察了

学习了！